A lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda) é uma das principais pragas da agricultura tropical, causando sérios prejuízos especialmente em culturas de milho e algodão. A adoção de plantas geneticamente modificadas para expressar proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis (Bt) tem se consolidado como ferramenta essencial no seu controle. Entretanto, a evolução da resistência, particularmente à proteína Cry1F, compromete a eficácia e a sustentabilidade dessa tecnologia. Este estudo avaliou a eficácia de diferentes piramidações de proteínas Bt (Cry1, Cry2 e Vip3A) no controle de S. frugiperda em algodão e milho. Foram conduzidos bioensaios de tempo-mortalidade com larvas de terceiro ínstar, provenientes de populações de campo, alimentadas exclusivamente com folhas de cultivares Bt expressando diferentes combinações de toxinas. Os resultados indicaram que as piramidações contendo Vip3A apresentaram desempenho significativamente superior. No algodão, a combinação Cry1Ac + Cry2Ab2 + Vip3A destacou-se, alcançando 50% de mortalidade em apenas três dias. No milho, as piramidações Cry1A.105 + Cry2Ab2 + Vip3Aa e Cry1A.105 + Cry2Ab2 + Vip3Aa + Cry3Bb1 foram as mais eficazes, resultando em mortalidade final entre 66% e 70%. Em contraste, combinações contendo Cry1F exibiram baixa eficácia (25–50%), refletindo a resistência já estabelecida em populações de campo. Destacamos que Vip3A representa uma proteína fundamental para a durabilidade das tecnologias Bt, devido ao seu modo de ação distinto e à ausência de resistência cruzada com proteínas Cry. Esses resultados reforçam a importância de selecionar piramidações estratégicas, priorizando o uso de Vip3A em regiões com histórico de resistência, e de integrar estas práticas a um manejo sustentável para assegurar a eficácia prolongada das proteínas Bt.