Introdução: As Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde representam um desafio significativo, especialmente no Serviço de Atendimento Móvel de Urgência, uma vez que as condições adversas e a falta de padronização aumentam os riscos de contaminação para pacientes e profissionais. Nesse sentido, a pandemia da doença do coronavírus de 2019 evidenciou ainda mais essas fragilidades e ressaltou, portanto, a necessidade de protocolos específicos para ambientes pré-hospitalares. Além disso, a literatura indica que a adoção de práticas baseadas em evidências pode reduzir em até 70% a incidência dessas infecções. Objetivo: Construir e validar o conteúdo, a linguagem, o layout, a motivação e a adequação cultural de um protocolo para a prevenção de Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde no Serviço de Atendimento Móvel de Urgência. Método: O estudo é uma pesquisa metodológica desenvolvida no Serviço de Atendimento Móvel de Urgência de Teresina, Piauí. O protocolo foi direcionado aos profissionais de saúde, como médicos, enfermeiros, técnicos de enfermagem e condutores socorristas, com o objetivo de padronizar as práticas de prevenção no atendimento pré-hospitalar. A elaboração ocorreu em duas etapas: a primeira definiu domínios e diretrizes, com base nas melhores práticas nacionais e internacionais; a segunda organizou o layout, em colaboração com o Núcleo de Educação em Urgências. A validação seguiu o método Delphi, com a participação de especialistas selecionados conforme critérios específicos de titulação e experiência. A coleta de dados utilizou formulários online, analisados por estatísticas descritivas, incluindo médias, desvio padrão e intervalo interquartil. O Coeficiente de Validade de Conteúdo foi calculado para cada item e para o protocolo como um todo, o que permitiu ajustes na versão final, garantindo a aplicabilidade prática do instrumento. Conclusão: Com base nos resultados obtidos, os especialistas validaram o protocolo e indicaram índices satisfatórios em todos os domínios avaliados. O domínio de Conteúdo obteve um coeficiente de 0,94, seguido por Linguagem, com 0,91, Layout, com 0,85, Motivação, com 0,94, e Adequação Cultural, com 0,85. O índice geral de validação do protocolo alcançou 0,91, o que evidenciou um alto grau de concordância entre os especialistas e reforçou a pertinência e a aplicabilidade das recomendações propostas para o contexto pré-hospitalar.