As infecções relacionadas à assistência à saúde, especialmente as infecções de sítio cirúrgico (ISC), representam um importante problema de saúde pública, estando associadas ao aumento da morbimortalidade, do tempo de internação e dos custos hospitalares. O presente estudo teve como objetivo analisar o perfil microbiológico, o padrão de resistência bacteriana e as práticas assistenciais relacionadas à prevenção de ISC em um hospital público de referência no estado do Piauí. Trata-se de um estudo observacional, retrospectivo, de abordagem quantitativa, realizado com 26 pacientes que desenvolveram infecção de sítio cirúrgico com confirmação laboratorial no período de 2023 a 2024. Os dados foram obtidos por meio de prontuários e registros do Serviço de Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde. Foi realizada análise descritiva e testes de associação entre variáveis categóricas, adotando-se nível de significância de 5%. Observou-se predominância de bactérias Gram-negativas, com destaque para Providencia sp., Acinetobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae e Escherichia coli, além de elevada frequência de resistência bacteriana, incluindo perfis multirresistentes e pan-resistentes. No que se refere às práticas assistenciais, identificaram-se fragilidades importantes no preparo pré-operatório, como ausência de consulta pré-anestésica, baixa adesão ao banho pré-operatório e inconsistências no controle glicêmico. Em relação às associações, não houve relação estatisticamente significativa entre especialidade cirúrgica e resistência bacteriana. Entretanto, observou-se associação entre a realização de tricotomia e a presença de resistência bacteriana, bem como entre o controle glicêmico e os diferentes perfis de resistência. Os achados evidenciam que a resistência bacteriana apresenta caráter multifatorial, estando relacionada à interação entre práticas assistenciais, perfil microbiológico institucional e uso de antimicrobianos. Destaca-se a necessidade de fortalecimento das estratégias de prevenção, com ênfase na padronização das condutas assistenciais, no aprimoramento do controle glicêmico, na execução adequada da tricotomia e no uso racional de antimicrobianos, visando à redução das infecções e à melhoria da qualidade da assistência.