O mercado global está em atualização contínua impulsiona avanços biotecnológicos que subsidiam centros produtivos com métodos inovadores, destacando-se bioprocessos de produção, purificação e aplicação de pectinases para a alimentação animal. Este trabalho teve como objetivo a produção, caracterização, purificação de pectinases produzidas por Trichoderma spp. utilizando casca de limão como fonte de substrato e sua aplicação em dietas de frangos de corte. Para tal, foram avaliadas 16 linhagens fúngicas, sendo T. orientale UFPI18 selecionada por apresentar atividade de 1,20 U/mL e atividade específica máxima de 83,75 U/mg. A otimização da fermentação em estado sólido foi conduzida por meio de um planejamento fatorial 2³, no qual foram estabelecidas como condições ideais de 35°C de temperatura, 50% de umidade, carga de 3 gramas de substrato e tempo de cultivo de 24 h, resultando em atividade pectinolítica de 1,45 U/mL e atividade específica de 4,82 U/mg. Durante o período experimental, a temperatura ambiente oscilou entre 14,85 e 33,0 °C, com média de 23,92 °C, enquanto a umidade relativa variou de 33% a 55%, com média de 44%. O índice de temperatura e umidade (ITU) apresentou valores entre 56,87 e 83,14, com média de 70,0, indicando condições próximas à zona de conforto térmico para frangos de corte, embora tenham ocorrido momentos de estresse térmico por calor nas horas mais quentes do dia. Segundo a literatura, valores de ITU acima de 79 representam ambientes perigosos para as aves, reforçando a importância do monitoramento climático durante os ensaios. Para a etapa de purificação, foram realizados 20 ensaios baseados em um planejamento fatorial 2⁴, avaliando-se a influência da massa molar do PEG (1500, 3350 e 8000 g/mol), da concentração de PEG (12–17%), da concentração de sal fosfato (12–18%) e do pH (6–8). O ensaio 15, conduzido com PEG 1500 g/mol, 17% de PEG, 18% de sal (fosfato de sódio) e pH 8,0, apresentou o melhor desempenho, com coeficiente de partição (K) de 0,82, recuperação de 93,35% na fase sal, fator de purificação máximo de 1,85 e balanço de massa de 108,16%. Eletroforese SDS-PAGE confirmou a natureza monomérica da pectinase com massa molecular de 46,0 kDa. Adicionalmente, os testes realizados demonstraram que a enzima não apresentou toxicidade, tanto nos ensaios com frangos de corte quanto em experimentos com cultura de células, evidenciando seu potencial de aplicação segura como aditivo enzimático. Os resultados demonstram que a produção de pectinases a partir de casca de limão por fungos filamentosos do gênero Trichoderma, aliada ao uso de métodos de purificação sustentáveis, como os sistemas aquosos bifásicos, constitui uma alternativa biotecnológica eficiente, economicamente viável e ambientalmente sustentável. Essa abordagem agrega valor a resíduos agroindustriais, reduz custos de processo e apresenta elevado potencial de aplicação industrial, especialmente no desenvolvimento de aditivos enzimáticos para a nutrição animal.