As secreções da pele de sapos são fontes de complexas misturas de compostos bioativos como por exemplo proteínas e peptídeos. A espécie Rhinella jimi é um sapo comum do nordeste brasileiro pouco estudada. Um planejamento experimental foi aplicado para otimizar o método de extração das proteínas das secreções da glândula paratoide de R. jimi, resultando na extração com tampão Tris-HCl 100 mM pH 7,2 com agitação vortex durante 5 min como a melhor condição de extração. O uso da técnica de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) combinada com a Análise de Componente Principal (PCA) revelaram sinais proteicos únicos aos extratos indicando que a metodologia proposta é adequada. Os extratos foram analisados por Cromatografia Liquida de Alta Eficiência por Exclusão de Tamanho (HPLC-SEC) e por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) que evidenciaram a presença de proteínas com altas e baixas massas moleculares (MM), apresentando diferenças, principalmente na região de baixa MM, entre amostras coletas nas cidades de Teresina-PI e Picos-PI (Brasil). A avaliação da citotoxicidade dos extratos contra as linhagens 4T1, CT26.WT e L929 revelou que a diferença na composição dos extratos também atinge suas atividades biológicas com valores de Concentração Citotóxica (CC-50) entre 258,9 e 49,7 µg/mL e não apresentando citotoxicidade em células normais (L929). As diferenças observadas entre as amostras podem ser atribuídas a condições edafoclimáticas do habitat encontrado em cada cidade. Estes novos dados apresentados são fundamentais para futuros estudos sobre a identidade e atividade biológica das biomoléculas presentes no veneno de R. jimi.