As plantas medicinais representam uma fonte rica e diversificada de compostos bioativos, como flavonoides e alcaloides e outros metabólicos secundários, com reconhecidas atividades anti-bacteriana, antioxidante e antitumoral. Esses compostos naturais têm se destacado como alter-nativas promissoras frente aos desafios contemporâneos da saúde pública, especialmente diante da crescente resistência bacteriana aos antimicrobianos e da elevada incidência de câncer. Nesse contexto, a espécie Macropsychathus violaceus (Mart. ex Benth.), destaca-se como potencial candidata à prospecção de novos agentes terapêuticos devido à diversidade de seus compostos bioativos. O presente estudo tem como objetivo caracterizar a composição química do extrato e investigar suas atividades antibacteriana, antioxidante e citotóxica por meio de estudos in vitro e in silico. O extrato bruto hidroetanólico (EBM), obtido das folhas com etanol/água (7:3) por maceração foi submetido a partição líquido-líquido para gerar as frações acetato de etila (FAE) e hexânica (FHEX). A caracterização química preliminar foi realizada por UV-Vis e FTIR. A atividade antibacteriana foi avaliada pelas Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) frente a cepas bacterianas sensíveis e resistentes. A antioxidante pelos métodos DPPH e ABTS, e a citotoxicidade pelo ensaio de viabilidade celular (MTT). As análises por espectroscópicas sugerem a presença de grupos funcionais compatíveis com flavonoides no extrato e frações. Em relação a atividade antibacteriana, apenas as frações FAE e FHEX apresentaram CIM e CBM de 500 μg/mL e 250 μg/mL, respectivamente, contra Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), enquanto as demais cepas exibiram CIM > 2000 μg/mL. Nos ensaios antioxidantes, FAE apresentou maior atividade (CI₅₀ de 4,47 μg/mL para DPPH e 2,74 μg/mL para ABTS. No ensaio de citotoxicidade, EBM e FHEX reduziram a via-bilidade de células HTC-116 (câncer colorretal humano) em 92% e 87%, respectivamente, e EBM reduziu em 86% a viabilidade das células MDA-MB-231 (câncer de mama), evidenci-ando seletividade para linhagens tumorais. Os dados obtidos demonstram o elevado potencial biológico do extrato e das frações de M. violaceus. Assim, essa espécie configura-se como uma promissora fonte de compostos bioativos com potencial aplicabilidade no desenvolvimento de novas terapias antitumorais e antimicrobianas mais eficazes e seguras.