A mucosite intestinal (MI) é um efeito colateral do tratamento quimioterápico com 5-Fluorouracil (5-FU) que ainda não possui terapia efetiva. Os produtos de origem natural têm sido amplamente pesquisados, entre eles a Epiisopiloturina (EPI) um alcaloide derivado da Pilocarpus microphyllus Stapf ex Wardleworth, que é reportado com potencial antinociceptivo, anti-helmíntico, anti-inflamatório e antioxidante. Assim, o presente estudo objetiva avaliar o efeito da EPI na MI induzida por 5-FU. Foi realizado um protocolo de 14 dias para a avaliação toxicológica da EPI, e investigou-se o efeito da EPI na MI. Os animais foram submetidos à indução da MI por meio da administração do 5-FU (450 mg/kg), em seguida tratados por quatro dias consecutivos após a indução, no quinto dia foram eutanasiados e realizou-se a remoção do duodeno, jejuno e íleo para avaliação da mucosite, através dos parâmetros de variação ponderal, número de leucócitos, análise histopatológica e morfométrica e avaliação do número de mastócitos. Após essa fase selecionou-se a dose de 10 mg/kg e o segmento jejuno para a execução da modulação da COX-2  com Celecoxibe. O material biológico foi retirado e avaliou-se a atividade antioxidante da EPI por dosagem de Malondialdeido (MDA), o número de células caliciformes, e o envolvimento da COX-2 na MI por meio de imunohistoquímica. Na terceira fase, foi realizada a modulação do óxido nítrico (ON) na MI com L-NAME e L-arginina, o envolvimento do ON foi avaliado por imunohistoquímica para iNOS e Docking molecular. Verificou-se que os animais tratados com EPI não apresentaram sinais clínicos de toxicidade, nem alterações no número de leucócitos e peso relativo dos órgãos. Observou-se ainda que a EPI não atenuou a perda de peso, porém foi capaz de prevenir as alterações morfométricas, histopatológicas e a leucopenia, de diminuir o número de mastócitos, reduzir a dosagem de MDA e preservar as células caliciformes, observou-se ainda a diminuição estatisticamente significante da área imunomarcada para COX-2 e iNOS além apresentar interação molecular com a iNOS. Diante disso, constatou-se que a EPI não é tóxica e que apresenta um efeito protetor na mucosa intestinal, por demonstrar propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias em modelo de mucosite intestinal induzida por 5-FU, com diminuição da expressão de COX-2 e iNOS.