As lesões cutâneas associadas a microrganismos patogênicos configuram um desafio crescente na prática clínica, intensificado pelo aumento da resistência aos agentes antimicrobianos convencionais. Diante desse cenário, o presente estudo descreve o desenvolvimento e a caracterização de um hidrogel termossensível formulado a partir de quitosana, gelatina e álcool polivinílico (PVA), contendo óleo essencial de Mesosphaerum suaveolens (L.) Kuntze, com foco em aplicações tópicas de caráter antimicrobiano. O óleo essencial foi obtido por hidrodestilação, alcançando rendimento médio de 0,41%, e teve sua composição química determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas, que identificou 20 constituintes, predominantemente monoterpenos e monoterpenoides. Entre os compostos majoritários destacaram-se sabineno (35,68%), fenchona (10,06%), 1,8-cineol (7,67%) e p-cimeno (5,85%). A incorporação do óleo à matriz polimérica foi evidenciada por Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier com Reflectância Total Atenuada (EITF RTA), a partir de alterações nas bandas de O–H e C–H e da ausência de picos característicos dos componentes individuais. A análise morfológica por microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostrou uma superfície regular no hidrogel sem a presença do óleo, enquanto as formulações contendo óleo exibiram cavidades esféricas associadas à sua dispersão, com maior heterogeneidade estrutural na concentração de 4%. O óleo essencial apresentou atividade antioxidante, com valor de CE₅₀ de 23,36 mg·mL⁻¹ e a quantificação de fenólicos totais revelou teor de 8,03 ± 0,08 µg EAG·mg⁻¹. Nos ensaios antimicrobianos por difusão em disco, o óleo livre demonstrou elevada eficácia contra Candida albicans, com halo de inibição de 31,5 mm, além de atividade moderada frente a Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Nos testes de contato direto, os hidrogéis sem incorporação do óleo promoveram inibição superior a 60% das colônias dos microrganismos testados, sendo de 97,6 para E. coli, 100% para S. aureus e 96,1% para C. albicans, na concentração de 4%. Os ensaios de citotoxicidade in vitro indicaram ausência de efeitos tóxicos em fibroblastos nas formulações contendo até 3% de óleo essencial (CI₅₀ > 3200 µg·mL⁻¹). Os resultados evidenciam que a veiculação do óleo essencial em hidrogel polimérico representa uma estratégia promissora para o desenvolvimento de sistemas tópicos biocompatíveis com atividade antimicrobiana.